爱西特治疗高磷血症的基础研究

活性炭在体外实验中对钙盐磷结合能力的影响贾萌1,2,3，程叙扬1,2,3，左力1,2,31.医院肾内科2.北京大学肾脏病学系3.卫生部肾脏病重点实验室摘要：实验背景：在维持性血液透析患者中普遍应用钙盐作为磷结合剂。钙盐有导致高钙血症和血管钙化的风险。口服活性炭是一种非选择性的高效吸附剂。我们推测其可能具有增强钙盐结合磷的能力，因此设计了体外实验证实这一假设。实验方法：制备磷浓度为10mmol/L的人工胃液和人工肠液。分别以不同剂量的氯化钙（0.g，0.g，0.g）及活性炭（0.15g，0.30g，0.45g）以及两者组合加入人工胃液或人工肠液中，在反应2小时后，提取上层清液检测磷浓度，之后计算磷浓度的下降值以及下降的百分比。比较单独使用氯化钙、活性炭及两者合用的磷结合能力。实验结果：在人工肠液中，加入不同剂量的氯化钙后，磷浓度下降的百分比无统计学差异（28.90±2.04vs.33.33±3.90vs.31.86±5.23）,加入不同剂量活性炭组之间磷浓度变化无统计学差异（3.33±0.08vs.3.26±0.01vs.3.36±0.11）。在人工胃液中，不同反应时间下（反应前，加入氯化钙反应一小时，再加入活性炭反应两小时）的磷浓度无统计学差异。在人工肠液中，氯化钙联合活性炭组磷浓度下降的百分比明显高于单独使用氯化钙组（48.23±5.55vs.30.72±6.11）实验结论：在人工胃液和人工肠液中单独使用活性炭不能结合磷。在人工肠液中，活性炭可增强氯化钙结合磷的能力。活性炭；高磷血症；磷结合剂；慢性肾脏病维持性血液透析患者普遍存在高磷血症，其可导致继发性甲状旁腺功能亢进及代谢性骨病。高磷血症可引起血管钙化，并可增加透析患者心血管疾病的发病率和死亡率[1,2,3]。目前，控制慢性肾脏病患者高磷血症的方法主要有：饮食限制磷摄入，口服磷结合剂以及充分的血液透析治疗。饮食上限制磷的摄入以及目前的透析治疗方式难以充分有效的维持血磷水平在推荐的目标范围内，所以，大部分透析患者需要口服磷结合剂。钙盐类磷结合剂可以有效的结合磷[4]，因其高效并且廉价，因此被广泛使用。活性炭(Activatedcharcoal,AC)因具有巨大的比表面积而成为一种高效吸附剂。其平均比表面积可以达-1,m2/g[5]。活性炭的吸附作用源于较弱的分子间作用力（范德华力），并且在活性炭量不足的情况下，其吸附的溶质可能发生解吸附。溶质的电离度和极性是影响吸附作用的重要因素。强电解质如氯化钠和硝酸钾不能被活性炭有效吸附，不溶性物质如氯化汞和碘则可以被活性炭吸附[6]。活性炭可以有效吸附大部分有机化合物，分子量大且水溶性差的化合物（如脂肪酸）比分子量小并带有极性基团（如酒精）的化合物更易被吸附[7]。由于pH值可影响溶质的极性，因此水杨酸在较低pH环境中更易被活性炭吸附（大部分水杨酸在此环境下处于非电离状态）。临床上很早就开始应用活性炭以治疗腹泻和药物中毒。其可有效吸附尿毒症毒素如肌酐、尿素、尿酸及吲哚。大规模的临床实验显示口服活性炭（AST-）可以延缓慢性肾小球肾炎患者肾功能衰退的进展[8]。KeijiHorike等学者发现在不影响血浆肾素-血管紧张素系统和蛋白质摄入的情况下，口服AST-可以延缓4/5肾切除SD鼠模型肾功能衰竭的进展，其发现对照组的血磷浓度要高于使用AST-组（6.6±0.3vs.5.9±0.3mg/dl），并且使用AST-组的尿磷排泄率要低于对照组（31.5±0.8vs.28.1±1.8mg/天）。他们推测活性炭的肾保护作用源于其作为磷结合剂减少了肠道吸收的磷。我们设计了体外实验测试在人工胃液和人工肠液环境下单独使用活性炭以及活性炭联合氯化钙结合磷的能力。实验材料和研究方法实验材料口服活性炭由长天药业公司（中国，保定）提供。目前国内大部分患者使用碳酸钙作为磷结合剂，由于碳酸钙在中性环境中溶解度低，因此本实验中使用氯化钙作为碳酸钙的替代物。实验中的化学试剂均为分析纯级。实验仪器溶液pH值测定使用奥利龙pH仪（美国奥利龙电子分析仪器公司）。磷结合力测试使用Crystal（IS-DRV1）恒温摇床（美国Crystal分析仪器公司）在37°C，转/分环境下进行。溶液磷医院检验科日立型自动生化仪（日本日立公司）。该生化仪检测磷浓度的上限为：6.46mmol/L，下限为0.06mmol/L。体外实验我们设计了四组体外实验研究活性炭是否可以增强氯化钙结合磷的能力。1.氯化钙在人工肠液中结合磷的能力使用磷酸二氢钾（KH2PO4）和蒸馏水配制磷浓度为49.97mmol/L的储备液。使用浓度为0.1M的NaOH溶液在奥利龙型pH仪监测下调节储备液pH值至6.8以接近肠液的生理pH值。使用蒸馏水，胰酶配置磷浓度为10mmol/L的人工肠液。实验前取溶液样本待测定。将三组不同剂量的氯化钙（0.g，0.g，0.g）分别加入含有50ml人工肠液的锥形瓶中，瓶口密封后置于Crystal恒温摇床中在37°C,转/分环境下反应2小时。后取出1.0ml溶液立即置入离心机（10,转/分，5分钟）离心后用移液器提取上层清液。测定反应前及加入氯化钙反应2小时后的磷浓度。计算反应后磷浓度下降的百分比。([phosphate]反应前-[phosphate]反应后)/[phosphate]反应前x%2.活性炭在人工肠液中结合磷的能力使用三组不同剂量活性炭（0.15g,0.30g,0.45g）分别加入含有50ml人工肠液的锥形瓶中，于反应前，反应2小时和反应4小时提取溶液样本，离心后测定上层清液磷浓度。3.氯化钙联合活性炭在人工肠液中结合磷的能力使用三组不同剂量活性炭（0.15g,0.30g,0.45g）联合三组不同剂量氯化钙（0.g，0.g，0.g）（总计9组不同的剂量组合）加入含有50ml人工肠液的锥形瓶中，于反应前及反应2小时后提取溶液样本，离心后测定上层清液磷浓度。4.氯化钙联合活性炭在人工胃液中结合磷的能力制备磷浓度为10mmol/L，pH为1.4的人工胃液。三组不同剂量的氯化钙（0.g，0.g，0.g）分别加入含有ml人工胃液的锥形瓶中反应1小时，提取样本后再加入0.15g活性炭反应2小时。所有样本提取后立即离心，后提取上层清液测定磷浓度。所有样本采用1:3稀释（微量进样器取样本ul，加ul蒸馏水）后，检测磷浓度。统计学分析实验结果以均数±标准差表示。采用方差分析，比较不同组别之间磷浓度下降值是否有显著性差异；几个平均值间进行两两比较，采用最小显著差法(leastsignificantdifference,LSD)检验；检验水准α取0.05，若P＜0.05，认为有统计学意义。应用SPSS17.0统计软件进行数据处理。如不同剂量氯化钙组间磷浓度下降百分比无统计学差异，则合并为一组。同理可将活性炭组合并。实验结果1.氯化钙在人工肠液中结合磷的能力不同组别加入氯化钙前磷浓度无统计学差异（3.41±0.04vs.3.48±0.16vs.3.33±0.17mmol/L）。加入不同剂量氯化钙后，各组间磷浓度下降的百分比无统计学差异（28.90±2.04vs.33.33±3.90vs.31.86±5.23%）（表1）。2.活性炭在人工肠液中结合磷的能力不同组别加入活性炭前（3.29±0.07vs.3.33±0.12vs.3.26±0.05mmol/L）、加入活性炭反应2小时（3.33±0.03vs.3.19±0.10vs.3.15±0.14mmol/L）及4小时后（3.33±0.08vs.3.26±0.01vs.3.36±0.11mmol/L）磷浓度均无统计学差异。因此，将同一时间点的三组数据进行合并，之后比较不同时间点间磷浓度变化，显示仍无统计学差异（3.29±0.08vs.3.22±0.12vs.3.32±0.08mmol/L）（表2）。3.氯化钙联合活性炭在人工肠液中结合磷的能力由（表1）和（表3）所示，由于人工肠液加入不同剂量氯化钙组其各亚组间磷浓度下降百分比无统计学差异（28.90±2.04vs.33.33±3.90vs.31.86±5.23%），人工肠液加入不同剂量氯化钙联合活性炭组间磷浓度下降百分比无统计学差异（47.49±5.28vs.45.50±6.78vs.51.70±1.95%），因此将上述各亚组合并为两组：氯化钙组及氯化钙联合活性炭组。我们发现：在人工肠液环境下，氯化钙联合活性炭组磷浓度下降的百分比明显高于氯化钙组（48.23±5.55vs.30.72±6.11%）（p0.）（表4）。4.氯化钙及活性炭在人工胃液环境下结合磷的能力不同时间点的磷浓度[反应前（3.±0.vs.3.±0.vs.3.±0.mmol/L），加入氯化钙反应1小时（3.±0.vs.3.±0.vs.3.±0.mmol/L），再加入活性炭反应2小时（3.±0.vs.3.±0.vs.3.±0.mmol/L）]无统计学差异（P0.05）。因此将各亚组合并，发现不同时间点间磷浓度仍无统计学差异（3.±0.vs.3.±0.vs.3.±0.mmol/L）（表5）。讨论依据目前我们的体外实验发现：在人工胃液环境下氯化钙及活性炭均无结合磷的能力；单独使用活性炭在人工胃液及人工肠液环境下均不能结合磷；在人工肠液环境下，活性炭可以增强氯化钙结合磷的能力。依据水溶液的pH值，磷酸盐以四种形式存在：（PO43-）、（HPO42-）、（H2PO4-）或（H3PO4）。在近中性环境下，钙离子可与磷酸根以CaHPO4或Ca(H2PO4)2的形式结合，上述两种钙磷复合物在pH值近中性时是不溶于水的，因此可以从溶液中沉淀并析出，由于活性炭可以吸附不溶性物质如氯化汞和碘，故我们推测活性炭也可以吸附上述两种钙磷复合物，由于钙磷复合物被活性炭吸附后从液相中被移除，因此形成钙磷复合物的反应平衡被打破，进而会形成更多的钙磷复合物，所以在人工肠液环境下活性炭可以增强氯化钙结合磷的能力。在强酸性环境下磷酸盐主要以H3PO4的形式存在，而Ca3(PO4)2，Ca,及Ca(H2)2均可溶于强酸。这就可以解释碳酸钙和醋酸钙在pH3的环境下失去磷结合能力的现象[10]。由于强电离性盐类如氯化钠或硝酸钾不能被活性炭吸附[6]，因此可以解释活性炭为何不能吸附人工胃液中的HPO42-、H2PO4-及H3PO4。我们设计的体外实验研究了活性炭及氯化钙在人工胃肠液中结合磷的能力，但未研究对食物中磷的结合能力。活性炭是一种高效、非选择性吸附剂，因此可能会吸附食物中的营养物质如：维生素，氨基酸，糖类等。在临床应用中，使用碳酸钙作为磷结合剂。碳酸钙本身无结合磷的能力。其在胃液中先与盐酸反应转变为氯化钙，之后再形成钙磷复合物。在我们目前的实验中发现，人工肠液中加入氯化钙后，磷浓度下降30.7%，氯化钙联合活性炭后可在此基础上进一步下降18.1%。我们推测如果在临床治疗中将碳酸钙与活性炭联合使用可以结合更多的磷。国内的两项临床研究报道，透析患者使用碳酸钙联合活性炭可以进一步降低血磷浓度[11,12]。在这两项临床研究中，作者发现碳酸钙的磷结合能力在加用活性炭后明显增强（患者血磷浓度比单独使用碳酸钙组下降了0.3mmol/L）。作者同时也发现加用活性炭后会导致一些副作用，一些患者出现便秘，而使用大黄类制剂可以缓解这一消化道副反应。但在这两项临床研究中未涉及活性炭对患者营养状况影响的研究。我们的体外实验显示在人工肠液环境下，活性炭可以增强氯化钙结合磷的能力。单独应用活性炭无结合磷的能力。提示在临床上可以应用钙盐类药物联合活性炭以更好控制血磷水平。此外还需要进行随机对照临床实验以进一步证实其可行性。由于活性炭是一种非选择性吸附剂，因此还需要评估使用活性炭作为磷吸附剂对患者营养状况的远期影响。参考文献：[1]LowrieEG,LewNL:Deathriskinhemodialysispatients:thepredictivevalueof







































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